Avaliação Laboratorial do Sistema Imunológico O sistema imunológico é dividido didaticamente em inespecífico, representado pelos sistemas de fagócitos e Complemento (C), e o específico, representado pela imunidade mediada por linfócitos B (humoral) e linfócitos T (celular). Entretanto, o que ocorre é uma ampla interação entre os diversos componentes da resposta imunológica, que permite prevenir e debelar as infecções, de forma mais eficiente. Aqui serão enfatizadas as provas laboratoriais mais utilizadas na avaliação imunológica de pacientes com infecções de repetição. As deficiências predominantemente humorais representam cerca de 60% das imunodeficiências primárias, em seguida temos as deficiências celulares e de fagócitos responsáveis por cerca de 20 e 18%, respectivamente. As mais raras são as do Sistema Complemento (C). No anexo I encontra-se a classificação das ID, segundo a IUIS. A avaliação da competência imunológica geralmente requer laboratório especializado e o custo financeiro é elevado. Em se tratando de pacientes pediátricos, outro aspecto a ser considerado é a escolha de métodos passíveis de serem executados com a menor quantidade possível de sangue. Por estes motivos, na suspeita de uma imunodeficiência, deve-se solicitar os exames que vão dar mais informações de acordo com a história clínica do paciente. Por exemplo, infecções de repeticão por bactérias extra-celulares sugerem deficiência predominantemente de anticorpos ou deficiência de proteínas do sistema Complemento. Por outro lado, infecções por bactérias intra-celulares e germes oportunistas sugerem deficiência da imunidade celular. Nas deficiências de fagócitos é comum história de abscessos de repetição tendo, principalmente, o Staphilococcus aureus como agente etiológico. O diagnóstico de algumas ID pode ser afastado, com pequeno custo, se forem utilizadas provas de triagem bem selecionadas. Um hemograma completo é certamente um dos exames mais informativos e de maior relação custo- benefício. Estando a contagem de neutrófilos normal, pode-se afastar a hipótese de neutropenias congênitas ou adquiridas e defeitos de adesão leucocitária. Número de linfócitos normal para idade exclui a imunodeficiência grave combinada e defeitos graves de células T. Na síndrome de Wiskott-Aldriclh, temos presença de plaquetopenia com presença de microplaquetas. Na suspeita de deficiência de anticorpos, as dosagens das imunoglobulinas séricas (A, G, M) fornecem informações úteis. O método mais barato, e ao mesmo tempo eficiente, para se avaliar a resposta imune celular, é a realização de testes cutâneos de hipersensibilidade tardia com o maior número possível de antígenos. Uma boa bateria de antígenos deve incluir PPD, SK-SD (varidase), tétano e candidina, por serem antígenos contra os quais a maioria da população está sensibilizada. Desta forma, torna-se altamente improvável que um indivíduo normal seja negativo a todos estes antígenos por falta de contato prévio. Em se tratando de crianças, entretanto, essa chance é muito elevada e, nesse caso, o teste com a Candidina é o que tem maior probabilidade de dar resultado positivo. No Brasil, devido a obrigatoriedade de vacinação precoce com BCG, o teste com o PPD é a melhor escolha. Se o teste for positivo, caracterizado por eritema e nódulo após 24-48 horas, estarão praticamente afastadas as suspeitas de deficiências graves de células T. O tamanho do nódulo não tem importância. Na suspeita de Imunodeficiência, independente do setor que possa estar acometido, os exames inicias a serem solicitados estão no Quadro I. De acordo com a suspeita diagnóstica devem ser solicitados exames mais específicos detalhados a seguir. Quadro I Exames Iniciais na Suspeita de uma Imunodeficiência 1.Hemograma 2.Níveis séricos de Imunoglobulinas : IgG, IgA e IgM 3.Teste cutâneo de Hipersensibilidade Tardia (PPD) I - Avaliação da Imunidade Humoral As ID humorais são as mais frequentes. A história clínica de infecções bacterianas de repetição como pneumonia, otite média aguda, meningite ou sinusite nos leva a suspeitar de uma deficiência de anticorpo. Ao exame físico é importante que se verifique a presença de órgãos linfóides que podem estar reduzidos ou ausentes nestes pacientes. A ausência de adenóide, comprovada pela radiologia de cavum, em crianças com infecções de repetição sugere, fortemente, uma agamaglobulinemia. Na suspeita de Imunodeficiência predominantemente humoral os exames iniciais a serem solicitados são: 1.Dosagem das imunoglobulinas séricas (IgA, IgM, IgG). É o primeiro exame a ser solicitado na suspeita de Deficiência de Anticorpo. Atualmente, este exame é realizado por um grande número de laboratórios em nosso meio. Por serem proteínas que existem em grande quantidade no nosso organismo, podem ser utilizados os métodos de imunodifusão radial ou nefelometria. Entretanto, alguns serviços, utilizam um método mais sensível como o imunoenzimático (ELISA). A sensibilidade e a especificidade dos três métodos são adequadas. Deve-se sempre comparar os resultados encontrados com valores de normalidade para mesma faixa etária. A IgG é a imunoglobulina de maior concentração plasmática, correspondendo a cerca de 80% das imunoglobulinas séricas sendo a classe principal das defesas sorológicas do nosso organismo. A meia-vida plasmática da IgG é de 23 dias. A IgM é a que alcança valores de adulto mais precocemente, e a IgA mais tardiamente. Níveis de IgM acima de 20 mg/dl em sangue de cordão são sugestivos de infecção intra-uterina. É a classe de anticorpo que predomina na resposta imune primária. A IgM tem potente ação ativadora do C, contudo por causa do seu tamanho (pentâmero) fica restrita ao compartimento intravascular. Nos dois primeiros anos de vida, os níveis de IgA são, geralmente, bem reduzidos. Valores de adultos são somente alcançados por volta dos 8 anos de idade. Na deficiência de IgA, a concentração sérica desta imunoglobulina é sempre menor que 7 mg/dl e o diagnóstico só deve ser confirmado após os 4 anos de idade. De acordo com os níveis de imunoglobulinas séricas, podemos formular as seguintes hipóteses diagnósticas: a) IgM e IgG normais e IgA diminuída = deficiência de IgA b) IgG e IgA normais e IgM diminuída = deficiência de IgM c) IgG e IgA diminuídas e IgM elevada = síndrome de hiper-IgM d) IgM, IgG e IgA diminuídas = hipogamaglobulinemia (agamaglobulinemia, hipogamaglobulinemia transitória da infância ou imunodeficiência comum variável). 2. Subclasses de IgG: Os anticorpos da subclasse IgG1 e IgG3 são, na maioria das vezes, timo-dependentes e direcionados a antígenos protéicos. Atingem níveis semelhantes aos do adulto por volta dos 2 anos de idade. A IgG1 corresponde a cerca de 60-70% da IgG sérica total, enquanto a IgG3 cerca de 4-8% do total. A IgG2 tem importante participação na resposta humoral contra antígenos de paredes bacterianas (carboidratos e polissacárides) que são timo-independentes. É a que mais demora a alcançar nível de adulto, por volta da adolescência. Contribui com cerca de 14 a 30% dos níveis de IgG total. A curva de normalidade para as 4 subclasses deve ser feita por cada laboratório, levando-se em conta os diferentes anticorpos monoclonais utilizados para suas dosagens. A dosagem das subclasses de IgG é um exame de custo elevado e é menos informativo que a determinação de anticorpos específicos. Desta forma, a avaliação funcional dos anticorpos deve ser solicitada uma vez que antígenos proteicos estimulam, preferencialmente, a produção das subclasses IgG1 e IgG3 enquanto que, antígenos polissacarídeos estimulam a produção de IgG1 e IgG2. 3.Avaliação funcional das imunoglobulinas. Uma resposta adequada a antígenos vacinais nos leva a crer que a apresentação do antígeno a células imune-específicas, a interação entre os linfócitos T e B e a produção de anticorpos estejam funcionando sem anormalidades. A resposta antígeno-específica para IgM pode ser avaliada pela pesquisa de anticorpos aos antígenos do grupo sanguíneo ABO. Lactentes com mais de 6 meses de idade já são capazes de produzir estes anticorpos. Este exame não tem valia para paciente do grupo sanguíneo AB. A avaliação funcional dos anticorpos das classe IgG pode ser realizada pela pesquisa de IgG específica a antígenos vacinais como tétano, sarampo, pólio e rubéola. Em imunodeficiências como agamaglobulinemia ou imunodeficiência comum variável, além de níveis reduzidos das concentrações das imunoglobulinas, a produção de anticorpo está prejudicada. Estando os exames acima normais e mantendo-se a suspeita de imunodeficiência humoral pelo quadro de infecções bacterianas de repetição apresentadas pelo paciente, pode-se solicitar a determinação de anticorpos a antígenos polissacarídeos. Caso a avaliação laboratorial resulte num diagnóstico de hipogamaglobulinemia, deve-se solicitar a determinação dos linfócitos B. 4. Dosagem de anticorpos a antígenos polissacárides: Os antígenos polissacárides estão presentes em bactérias encapsuladas como Haemophilus influenzae tipo b (Hib) e Streptococcus pneumoniae. Lactentes respondem de forma inadequada a estes antígenos, sem significar deficiência do sistema imunológico, devendo a resposta a estes antígenos ser avaliada após os 2 anos de idade. Atualmente, a vacina anti-Hib conjugada a antígenos proteicos tem sido utilizada de rotina em lactentes, desta forma, a verificação de produção de anticorpos a antígenos polissacárides não é válida nos indivíduos que utilizaram esta vacina. A avaliação pode ser realizada dosando-se anticorpos pré e pós imunização (vacina polissacarídea) ao Streptococcus pneumoniae. É importante que os níveis de anticorpos sejam dosados antes e cerca de 4 a 8 semanas após a imunização. Os valores pré e pós-imunização para cada sorotipo são comparados e verifica-se se houve resposta adequada a esta bactéria. Temos dosado anticorpos aos sorotipos 1, 3, 5, 6B, 9V e 14 do Streptococcus pneumoniae e consideramos resposta adequada ao sorotipo quando os níveis de anticorpos são maiores ou iguais a 1,3 mcg/ml ou ocorre um incremento de 4 vezes do valor pós em relação ao pré-imunização. 5.Avaliação dos linfócitos B: Os linfócitos B são responsáveis pela produção das imunoglobulinas. Defeitos de maturação podem se manifestar por uma redução acentuada dos níveis de imunoglobulinas, entretanto, defeitos menores na diferenciação destes linfócitos podem levar a produção em níveis adequados de imunoglobulinas, mas com função alterada. A identificação de linfócitos B tem sido realizada pela citometria de fluxo. Os anticorpos monoclonais anti-CD19 e CD20 identificam células pré-B e B. O CD21 é outra importante molécula funcional de linfócitos B maduros. Os linfócitos B encontram-se em maior quantidade no lactente que no adulto. Estes linfócitos encontram-se ausentes ou muito reduzidos em sangue periférico de pacientes portadores de agamaglobulinemia. Entretanto, estão em número normal ou levemente reduzido nas outras Deficiências predominantemente humorais. Quadro II Avaliação da Imunidade Humoral Exames Inicias 1.Dosagem de IgG , IgA , IgM séricas 2.Dosagem de Isohemaglutininas 3.Dosagem de Anticorpos Vacinais: ex: Rubéola, Poliovirus, Sarampo Exames Complementares 1. Subclasses de IgG 2. Níveis de anticorpos após vacinas com antígenos polissacárides (pneumococos) 3.Quantificação de Linfócitos B (CD19) II - Avaliação da Imunidade Celular As ID celulares são, sem dúvida, as mais graves, muitas vezes vindo acompanhadas de deficiência de anticorpos sendo, então, denominadas ID combinadas. Infecções por fungos ou germes oportunistas são frequentes assim como infecções virais graves. Devido a gravidade do quadro clínico, o diagnóstico deve ser realizado o mais precocemente possível e o tratamento recomendado em algumas destas ID é o transplante de medula óssea. Na suspeita de deficiência da imunidade celular, devem ser realizados os seguintes exames: 1. Hemograma para verificação de número de linfócitos. No primeiro ano de vida, o número de linfócitos situa-se por volta de 4000/mm3, este número tende a reduzir com a idade, atingindo uma média de 1500/mm3 na idade adulta. Lactente com 1000 a 1500 linfócitos/mm3 é portador de linfopenia. 2.Raio-X de tórax para visualização da imagem tímica. 3. Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia (DTH) A reação cutânea de hipersensibilidade tardia (DTH - delayed test hypersensitivity) é uma resposta inflamatória caracterizada por um infiltrado de células mononucleares, constituído por linfócitos T de memória que, em presença do antígeno específico, liberam citocinas recrutadoras de macrófagos. Conforme já referido nas provas de triagem, é o método mais simples e eficaz para a avaliação da imunidade mediada por células. A prova consiste em inocular 0,1 ml da preparação antigênica por via intradérmica. Nenhuma reação costuma ser observada até 5-10 horas, após o que começa a se desenvolver uma reação eritematosa e formação de um nódulo que aumenta, progressivamente, até atingir o máximo 24-48 horas após a inoculação. Reações de DTH guardam boa correlação com outras provas de avaliação de imunidade celular. A principal limitação para a interpretação dos resultados negativos é que o teste pressupõe sensibilização prévia e, em crianças, a possibilidade de que ainda não tenha havido contato é muito grande. A utilização de vários antígenos comuns, para os quais mais de 90% da população responde a pelo menos dois, minimiza o problema. Dependendo da faixa etária, as dúvidas podem persistir. Lactentes com menos de 6 semanas de vida raramente apresentam DTH positiva. A partir dessa idade, podem apresentar resposta, se forem previamente sensibilizados. Em nosso meio, os antígenos mais utilizados são: PPD, Candidina, tétano, difteria e SK-SD. Anergia cutânea está associada a uma série de condições como: infecções sistêmicas agudas ou crônicas, deficiência de linfócito T, doenças autoimunes, desnutrição grave e condições que levam a imunossupressão: câncer, medicação imunossupressora e doenças renais. 4. Quantificação de linfócitos T "in vitro" A identificação e quantificação de linfócitos, no sangue periférico ou em tecidos, tornou-se um teste laboratorial relativamente comum. É de grande aplicabilidade para caracterização de desordens linfoproliferativas, acompanhamento de infecção por HIV e identificação de possíveis deficiências imunológicas. Uma tentativa de classificar e prover uma nomenclatura uniforme aos vários marcadores de superfície iniciou em 1980 quando um esforço foi realizado no sentido de se criar um sistema e codificar diferentes antígenos leucocitários. Foi criado o termo "cluster of differentiation" (CD) e um número específico foi dado para identificar estes marcadores celulares. Cada CD refere-se a uma determinada molécula de superfície celular caracterizada por um conjunto de anticorpos monoclonais padronizado pelos comitês internacionais. O grande número de monoclonais gerados contra moléculas presentes em linfócitos T permite identificar, atualmente, subpopulações de células efetoras, assim como, diferentes estágios de ativação e de maturação. O melhor marcador para linfócitos T totais é o CD3, uma vez que se refere a um complexo molecular associado aos receptores específicos (TCRs). Além de exclusivo de linfócitos T, encontra-se presente em todas as subpopulações de células T maduras. A caracterização de linfócitos CD3+, geralmente inclui a quantificação das subpopulações CD4+, comumente referida como auxiliadora (Th= T helper), e CD8+, que apresenta propriedades citotóxicas (Tc). Essas subpopulações ainda podem ser subdivididas com base em outros marcadores menos utilizados (CD45, CD25, etc.) A quantificação de células "natural killer" (NK) se faz pela identificação de CD16 e CD56. A presença de um ou dois destes marcadores em células CD3 negativas caracteriza a população NK. O método mais utilizado atualmente para fenotipagem de linfócitos é a citometria de fluxo. Baseia-se na incubação do sangue periférico com um ou mais anticorpos monoclonais (anti-CD) conjugados à fluoresceína e/ou outro fluorocromo. A quantificação das células positivas para o respectivo CD processa-se em microscópio de fluorescência ou, preferencialmente, por citometria de fluxo. A utilização de 2 fluorocromos, simultaneamente, permite identificar, de uma só vez, até 4 populações celulares: duplo negativas, duplo positivas, positivas apenas para o primeiro ou para o segundo marcador. 5. Resposta linfoproliferativa a mitógenos "in vitro" Existem situações nas quais a avaliação qualitativa da imunidade celular está indicada. A melhor forma de se avaliar funcionalmente os linfócitos T é através da resposta proliferativa a mitógenos "in vitro". O estímulo mais amplamente utilizado é a fitohemaglutinina (PHA) que ativa, inespecificamente, a totalidade das células T. A leitura é feita num contador de cintilações e o resultado é dado em contagens por minuto (cpm). Uma resposta linfoproliferativa em padrões normais significa que etapas fundamentais da resposta mediada por linfócitos T estão preservadas: blastogênese, células acessórias (monócitos) funcionantes, linfócitos T produzindo IL-2 (interleucina 2 = fator de proliferação de linfócitos T) e expressando receptores para IL-2 adequadamente e, finalmente, ausência de fatores inibidores no soro do paciente. No caso de uma resposta linfoproliferativa deficiente, testes adicionais poderão estabelecer qual o ponto responsável por esta resposta insatisfatória. Nas deficiências primárias de células T ou combinadas o número de células T e a resposta proliferativa encontram-se reduzidos. Quadro III Avaliação da Imunidade Celular Exames Inicias 1.Hemograma : morfologia e número de Linfócitos 2.Rx de Tórax : Imagem Tímica 3.Testes Cutâneos de HipersensibilidadeTardia : PPD, Candidina, SK-SD, Tétano Exames complementares 1.Quantificação de Linfócitos T:CD3, CD4 e CD8 2.Resposta linfoproliferativa a fitohemaglutinina (PHA) III. Avaliação de Fagócitos Neutrófilos são células de vida curta que agem como células efetoras contra muitos tipos de bactérias e fungos. Após opsonização do antígeno, pelos anticorpos ou proteínas do sistema Complemento, uma quantidade considerável de fagócitos é recrutada ao local de inflamação para que ocorra a fagocitose. A fagocitose induz a um metabolismo oxidativo conhecido como "burst" respiratório, sendo produzida uma série de substâncias como peróxido de hidrogênio(H2O2), radicais de hidrogênio(OH-), ânion superóxido(O2-), oxigênio (1O2), que juntas vão ser tóxicas, resultando na morte do microorganismo fagocitado. Um defeito no recrutamento dos neutrófilos ou em qualquer uma das etapas de fagocitose ou da capacidade bactericida pode ser responsável pela ID resultando em maior susceptibilidade do hospedeiro a infecções. Nas deficiências de fagócitos, infecções supurativas são frequentes: adenites, abscessos cutâneos e pulmonares, osteomielite etc.. O Staphilococcus aureus é agente etiológico frequente nestas infecções. As deficiências de neutrófilos podem ser quantitativas ou qualitativas. Os testes para avaliação funcional, por demadarem bastante tempo e não serem solicitados com frequência, geralmente só são realizados em laboratórios especializados. 1.Avaliação quantitativa de neutrófilos: Hemograma. Neutropenia tem sido definida como uma contagem de granulócitos menor que 1500/mm3. Entretanto, deve-se levar em conta a idade e características raciais do paciente. 2.Análise qualitativa dos neutrófilos: 2.1.A morfologia dos neutrófilos circulantes deve ser cuidadosamente avaliada uma vez que na síndrome de Chediak-Higashi são encontrados inclusões gigantes intracelulares. 2.2.O teste do NBT (nitroblue tetrazolium) é o mais utilizado para triagem de Doença Granulomatosa crônica (CGD - chronic granulomatous disease). É um exame de fácil execução e baixo custo que reflete a geração de superóxido do "burst" respiratório após a fagocitose. O NBT é um corante amarelo que passa a azul-escuro após sofrer redução. O teste consiste em incubar as células com o NBT e estimulá-las com PMA (phorbol myristate acetate) que age como ativador celular. Células normais reduzem o corante e este fica azul-escuro. Quando não há redução o corante permanece claro. Indivíduos normais apresentam redução em mais de 90% dos neutrófilos. 2.3. Capacidade bactericida: a morte do microorganismo intracelular é a etapa final do fagócito frente a um microrganismo. Em algumas imunodeficiências, esta etapa está comprometida como na CGD, síndrome Chediak-Higashi, deficiência de molécula de adesão (LAD - leukocyte adhesion defect), deficiência de mieloperoxidase, deficiência de glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD). A avaliação da capacidade bactericida do fagócito "in vitro" pode ser feita utilizando-se bactérias ou fungos. Os granulócitos do paciente são incubados com cepas da bactérias opsonizadas e, após incubação, é contado o número de bactérias vivas. Geralmente, após 30 minutos, cerca de 90% das bactérias estão mortas quando em presença de granulócitos normais. 2.4 Moléculas de adesão. Para avaliar a presença de moléculas de adesão na superfície de leucócitos pode-se utilizar a citometria de fluxo. Na deficiência de LAD, há uma redução da expressão do complexo CD18/CD11 devido a um defeito intrínseco na síntese da cadeia b da molécula CD18. 2.5. A mieloperoxidase é a enzima responsável pela atividade da peroxidase dos grânulos azurófilos dos neutrófilos e responsáveis pela cor verde do pus. Esta enzima é importante na morte do microorganismo pois gera produtos tóxicos após reagir com o H202 na presença de hálides. A deficiência desta enzima leva a uma maior susceptibilidade a infecções por fungos e staphilococos. O diagnóstico pode ser facilmente dado utilizando uma coloração para peroxidase em sangue periférico. 2.6. Nível sérico de IgE : é importante na suspeita da síndrome da Hiper-IgE. Nesta síndrome, os pacientes apresentam dermatite seborreica e atópica graves, abscessos de repetição, principalmente pelo Staphilococcus aureus. Quadro IV Avaliação dos Fagócitos Exames Iniciais 1.Hemograma : número e morfologia dos neutrófilos e monócitos 2.Teste do N.B.T. Avaliação do Sistema Complemento As proteínas do sistema complemento (C) são um grupo de proteínas plasmáticas termo-sensíveis que interagem seqüencialmente após ativação, mediando processos inflamatórios, realizando a depuração de imunocomplexos, destruindo bactérias através da lesão da membrana e neutralizando vírus. Há duas vias de ativação deste sistema: clássica e a alternativa. As concentrações dos diferentes componentes do C no sangue do RN a termo atingem valores entre 50% e 70% dos observados em adultos normais, com exceção de C9, cujos níveis são de 16%. Ao final do primeiro ano de idade, todos os componentes atingem valores semelhantes aos de adultos normais. Esses baixos níveis séricos dos componentes do C em relação aos de adultos são parcialmente responsáveis pela atividade opsônica reduzida do soro do RN, menor capacidade em lisar bactérias Gram-negativas e alguns vírus, menor geração de processo inflamatório assim como quimiotaxia diminuída de polimorfonucleares e monócitos. A triagem para avaliação da via clássica do sistema complemento inclui a medida funcional do sistema através da dosagem do complemento hemolítico total, que nos dá uma idéia da integridade funcional da cascata. A dosagem do CH50 mede a atividade hemolítica de diluições séricas do soro do paciente incubado com uma preparação padrão de hemácias de carneiro sensibilizadas. O CH50 é a diluição do soro que produz 50% de lise destas hemácias em condições pré-estabelecidas e é expresso como a recíproca da diluição que dá 50% de hemólise. Deficiência dos fatores B, D ou properdina não afetam o CH50. Desta maneira, deve-se verificar a atividade da via alternativa (AP50). Na presença de CH50 baixo deve-se realizar as dosagens individuais das proteínas para se saber qual é deficiente. Quadro V Avaliação do Complemento Exames Iniciais 1.Complemento Hemolítico Total (CH50) Referências Bibliográficas recomendadas BELLANTI, J.A.- Clinical Immunology. Pediatr. Clin. North Am., 41(4), 1994. COSTA-CARVALHO, B.T.; NUDELMAN, V.; CARNEIRO-SAMPAIO, M.M.S. - Mecanismo de Defesa contra Infecção. Jornal de Pediatria, suppl.1:S3-S11, 1998. FLEISHER, T.A & TOMAR, R.H. - Introduction to Diagnostic Laboratory immunology. JAMA, 278(22):1823-1834, 1997 FUJIMURA, M.D. - Níveis séricos das subclasses de IgG em crianças normais e nefróticas. São Paulo, 1991 - Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo. HANNET I, ERKELLER-YUKSEL F, LYDYARD P, DENEYS V, DEBRUYÈRE M. Developmental and maturational changes in human blood lymphocyte subpopulations. Immunology Today, 13(6):215-218, 1992. HUSTON, D.P. - Diagnostic Laboratory Immunology. 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